You're Reading a Free Preview
Pages 7 to 15 are not shown in this preview.
LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA “ ISOLASI DNA METODE KITCHEN PREPARATION ” Disusun Oleh : ANITA CITRA AGUSTINA 4411416038 KHOIRINIDA SUFTIYANI PUTRI 4411416053 MUMTAZ AMMARUL HAQ 4411416066 FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG 2018 A. JUDUL PRAKTIKUM “ Isolasi DNA Metode Kitchen Preparation “ B. TUJUAN Tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut : 1. Melakukan isolasi DNA melalui metode kitchen preparation. 2. Mengetahui ujud/profil DNA C. LANDASAN TEORI DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012) Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007). DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012). Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010). Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010). Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) : 1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan. 2. pemecahan dinding sel. 3. pemecahan membran sel. 4. pemisahan DNA dari bahan yang lain. Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar (Tohib, 2012). Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012). Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisasisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010). D. ALAT DAN BAHAN Alat: 1) Beaker gelas 6) Tabung reaksi 2) Pisau 7) Gelas kimia 3) Pengaduk 8) Pipet tetes 4) Penyaring 9) Gelas ukur 5) Spatula 10) Corong saring Bahan : 1) Jus Strawberry 2) Aquadest 3) Etanol 96% 4) Garam 5) Detergen cair E. CARA KERJA Mengambil 2 buah strawberry dan 1 spatula garam kemudian memasukkan ke dalam plastic lalu mengancurkan buah strawberry sampai lembut. Memasukkan seluruh hasil penghancuran buah ke dalam beker glass dan menambahkan dengan 5 ml aquadest. Menyaring isi beker glass menggunakan penyaring dan tempatkan pada gelas ukur. Memasukkan hasil saringan sebanyak 5 ml kedalam tabung reaksi. Menambahkan 2 ml deterjen dengan konsentrasi 25 % kemudian mengocok selama 10 menit. Menambahkan etanol dingin 2 x volume Mengamati ada tidaknya benang putih. F. DATA PENGAMATAN/HASIL Kelompok Sampel Konsentrasi Garam Hasil Deterjen 1 Strawberry 5% 1 spatula Ada sedikit 2 Strawberry 10 % 1 spatula Ada sedikit 3 Strawberry 15 % 1 spatula Tidak ada 4 Strawberry 20 % 1 spatula Ada sedikit 5 Strawberry 25 % 1 spatula Ada banyak 6 Strawberry 10 % ½ spatula Ada sedikit 7 Strawberry 10 % 1 spatula Ada banyak 8 Strawberry 10 % 1 ½ spatula Ada sedikit 9 Strawberry 10 % 2 spatula Ada sedikit 10 Strawberry 10 % 2 ½ spatula Ada sedikit G. PEMBAHASAN DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. Isolasi DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA untuk berbagai tujuan. Sebenarnya telah ada metode standar dalam mengisolasi DNA, misalnya teknik atau metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989). Isolasi DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. Isolasi DNA ini membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat ) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA. Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur. Isolasi DNA metode Kitchen Preparation menggunakan detergen sebagai alternatif pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas sebagai pengganti enzim protease. Sedangkan bahan yang akan dilihat DNA nya adalah strawbwrry, hal ini dikarenakan strawberry mudah dihancurkan. Selain itu, strawberry matang menghasilkan enzim pectinase dan selulase yang membantu memecah dinding sel. Strawberry yang umum dibudidayakan adalah octoploid dengan delapan set genom. Hal ini sangat baik untuk menunjukkan ekstraksi DNA karena memiliki delapan dari setiap jenis kromosom yang juga dikatakan bahwa strawberry memiliki DNA yang berlimpah. Berdasarkan hasil literature didapatkan hasil bahwa antara detergen cair, bubuk, dan cream yang seharusnya mempunyai daya rusak paling tinggi dalam memecah membran sel adalah detergen cair. Karena di dalam detergen cair mengandung konsentrasi yang tinggi misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen cair. Menurut Jamilah (2005: 95), detergen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Etanol 96 % dingin yang berfungsi membantu proses pengendapan terhadap organel-organel yang sudah keluar dari sel atau memisahkan bagian-bagian yang terurai tersebut berdasarkan berat molekul. Presipitasi pada benang-benang DNA.Ethanol tersebut mampu membawa asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik ke permukaan, untuk kemudian diendapkan Ethanol berperan dalam pengumpulan dan penggumpalan DNA karena sifatnya yang dingin. Ditinjau dari faktor penambahan garam ke dalam larutan detergen pada proses isolasi DNA, garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994, dalam Jamilah, 2005: 21). Dari pernyataan tersebut, nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan dan untuk mengendapkan kotoran-kotorannya sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati. Konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain: keenceran sumber DNA yang digunakan dan suhu ethanol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Sementara semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. menambahkan bahwa semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. H. SIMPULAN DAN SARAN a. Simpulan 1. Untuk melakukan isolasi DNA metode atau teknik yang digunakan pada dasarnya ada tiga yaitu: pelisisan sel, ekstraksi, dan pemurnian. Pelisisan dapat dilakukan dengan cara mekanik maupun kimia. Ekstraksi dapat dilakukan dengan penambahan garam dapur (NaCl) dan pemurnian salah satu metodenya adalah dengan memberikan larutan ethanol dingin 96%. 2. DNA yang terlihat berbentuk serabut-serabut berwarna putih yang tidak terlarut dalam etanol tapi terlarut dalam air. b. Saran 1. Seharusnya waktu yang disediakan untuk mengamati proses pemisahan DNA lebih lama agar DNA dapat lebih jelas terlihat 2. Sebaiknya laboratorium menyediakan alat yang cukup memadai serta alat yang cukup banyak, agar praktikum dalam berjalan dengan efisien. I. LAMPIRAN a. Daftar Pustaka Asris. 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA. //asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/.diakses pada 29 Mei 2018 Elrod, S, Stansfield, W. 2007. Genetika Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang Kirsman. 2010. Isolasi DNA Buah. Jakarta. Rachmat. 2012. Isolasi DNA. Jakarta. Tohib, W. 2012. Plant Breeding. Dewa Ruci Press. Jakarta. Suryo, 2012. Genetika Strata 1. Gajah Mada University Press. Yogyakarta. Yuwono, Tribowo, 2006. Bioteknologi Pertanian. Gajah Mada University Press. Yogyakarta. b. Foto/Dokumentasi c. Soal Pertanyaan 1. Menurut saudara, apakah prosedur isolasi kitchen preparation dapat digunakan untuk isolasi DNA dari jaringan hewan? Jelaskan. 2. Bagaimana ujud DNA yang anda peroleh? Jawaban 1. Menurut saya metode kitchen preparation tidak dapat digunakan untuk mengisolasi DNA jaringan hewan karena jaringan hewan memiliki struktur yang lebih kompleks dibandingkan dengan struktur jaringan tumbuhan sehingga tidak dapat diisolasi dengan teknik yang sederhana. 2.
Ujud DNA yang saya peroleh dari praktikum ini yaitu berbentuk serabutserabut berwarna putih.